Nel 1532, con le cosiddette Ordinazioni, elaborate da una Balia di dodici cittadini, fu emanata una serie di modifiche alla costituzione, per cui al tradizionale governo di una "Signoria", composta da un gonfaloniere e un collegio di priori, si sostituiva un compromesso tra oligarchia e principato, secondo cui Alessandro sarebbe subentrato al gonfaloniere con il titolo ereditario di "duca della Repubblica Fiorentina", affiancato da un Consiglio di duecento cittadini ed un Senato di quarantotto membri: ai priori si sostituiva un Consiglio ristretto di quattro membri del Senato, rinnovabili trimestralmente. Il riconoscimento della nuova situazione istituzionale da parte dell'imperatore sancì il definitivo passaggio al principato mediceo.
In realtà il governo di Alessandro si reggeva su un sistema quanto mai instabile, minato da una parte dagli interessi di potere interni alla dinastia, dall'altra dai contrasti e dalle opposizioni di coloro che mal sopportavano il governo dispotico del principe. Tutti i provvedimenti adottati dal duca per consolidare la propria posizione di reggente (creazione di un apparato burocratico e militare, misure poliziesche, costruzione di fortezze ecc.) non fecero che inasprire i rapporti con le famiglie dell'aristocrazia da una parte e con i "popolari", ossia i fautori della repubblica, dall'altra.
Con la morte di Clemente VII (1534) l'equilibrio già precario non resse all'opposizione promossa da una coalizione di "grandi", sostenuti da Ippolito de' Medici, divenuto nel frattempo cardinale, contro il governo di Alessandro: abbandonata Firenze, invocarono un nuovo intervento di Carlo V perché restituisse la libertà alla città.
A difesa del duca si schierarono molti esponenti dell'oligarchia fiorentina, tra cui Francesco Guicciardini, fedeli ai Medici sia per legami di parentela che per interessi economici. Grazie alla loro abilità diplomatica, nel gennaio 1536 nel momento in cui si venne a Napoli al giudizio arbitrale, Carlo V si pronunciò a favore di Alessandro, che, unitosi in matrimonio con la figlia naturale dell'imperatore Margherita d'Austria, poté tornare a Firenze da trionfatore.
Lo attendeva però una tragica fine: Lorenzino de' Medici lo uccise con l'aiuto di un sicario, nella notte tra il 5 e il 6 gennaio 1537.
Con questo atto si concludeva la storia del ramo primogenito della dinastia, in quanto il duca non aveva figli legittimi, e si apriva l'accesso al potere al ramo collaterale della casata: il successore, infatti, fu Cosimo di Giovanni dalle Bande Nere.